Trizol,RNA提取試劑盒現(xiàn)貨熱賣，歡迎

Trizol 使用說明書
描述：TRIzol 是一種快速從組織細胞中提取總RNA 的單相試劑。在樣品裂解過程中TRIzol 能夠抑制RNA 酶
活性保持RNA 完整性；加入氯仿后離心，RNA 相將與DNA 和蛋白質(zhì)分離，隨后用異丙醇沉淀RNA。如果需要
還可以繼續(xù)提取DNA 和蛋白質(zhì)。純化的總RNA 可用于RT－PCR、Northern Blot、RNA 酶保護、Poly(A) mRNA
純化、體外翻譯等實驗。
儲存: 4 oC 密封避光保存兩年有效。
適用: (1) 固體組織(100 mg /ml ): 人、動物、植物的各種新鮮或凍存組織。
(2) 培養(yǎng)細胞(5~10 x 106 細胞/ml): 真核細胞，細菌，酵母。
(3) 液體標本(100 μl/ml): 全血、體液、尿液，病毒樣品等。
操作準備：
極微量的RNA 酶都會導致RNA 降解。分離RNA 時RNA 酶污染主要來自以下五個方面：(1) 實驗人員的雙手。
(2) 器皿、吸頭離心管、自備液體。(3) 組織細胞破碎不可避免地釋放的內(nèi)源RNA 酶。(4) RNA 未能*與
蛋白質(zhì)分離。(5) RNA 沉淀和溶解時來自吸頭離心管和溶液。Trizol 可抑制RNA 酶活性, 因此在有Trizol
存在的步驟中，使用高壓消毒20 分鐘的吸頭離心管和溶液即可勝任RNA 提取操作。然而在RNA 溶解之后，
來自實驗材料的RNA 酶污染將會導致RNA 降解，應嚴格使用高壓滅活RNA 酶的用品。戴手套無疑是有益的，
但戴口罩和帽子則無必要。
1. 固體組織破碎設(shè)備。準備下列裝置之一，1)玻璃勻漿器。必要時泡酸清潔，用高壓滅菌蒸餾水洗滌數(shù)次。
2)研缽。適用于液氮凍存組織的研磨，清洗方法同玻璃勻漿器。3)組織細胞超聲破碎儀器。探頭插入裝
滿蒸餾水的試管或燒杯中，開啟超聲清洗探頭30 秒至1 分鐘。4)高速機械勻漿器(Polytron，Tekmar
或類似產(chǎn)品)。打開開關(guān)，在蒸餾水中清洗分散器頭數(shù)次。
2. 高壓蒸汽30 分鐘消毒一次性吸頭離心管。RNA 沉淀和溶解之后，應嚴格使用高壓消毒的一次性用品。
由于不可預測的原因，如：動物已經(jīng)處死，組織已取出，細胞已收取，而吸頭和離心管尚未高壓處理。
此時保險做法是使用普利萊基因技術(shù)公司的另種產(chǎn)品――組織RNA 保護液(Cat# R1030)，用戶可把來不
及處理的標本保存在RNA 保護液中，37 oC 保存3 天，25 oC 保存2 周，4 oC 保存4 周，－20 oC 保存數(shù)
月，固體或液體標本中RNA 不會降解。
3. DEPC 處理的雙蒸水。加DEPC 到水中至終濃度為0.01% v/v，室溫過一夜，高壓消毒30 分鐘。用于溶解
RNA，配制TE 緩沖液和75％乙醇。
4. 普通雙蒸水。高壓消毒30 分鐘，用于沖洗器皿，配制瓊脂糖凝膠和電泳用緩沖液。注意溶液配制后高
壓滅菌，但瓊脂糖不能高壓處理。
5. 冰盒和濕冰。在冰上進行操作有助于減少RNA 降解。
6. 異丙醇，氯仿，純乙醇，分析純。75％乙醇用高壓消毒的蒸餾水配制。
7. 其它用品。電泳槽，雙蒸水沖洗。離心機和加樣器，無需處理。
8. 戴手套。注意某些實驗如提取質(zhì)粒DNA 使用大量RNA 酶，為防污染須特別清洗實驗器具和實驗區(qū)域。
RNA 提取程序：
1. 組織細胞破碎與裂解
冰上操作快速破碎組織至關(guān)重要。組織細胞過量不僅使RNA 得率下降，還將導致DNA 和蛋白質(zhì)污染。
(1) 固體組織。按比例每50-100 mg 組織加1 ml Trizol 試劑。用研缽研磨：僅適用于液氮凍存組織。
組織放在研缽中研成粉末，加1 ml Trizol 試劑，繼續(xù)研磨至組織*裂解。用玻璃勻漿器勻漿：加入Trizol
上下手動勻漿組織10-15 次。用高速機械勻漿器：將組織放入塑料試管內(nèi)，試管置冰浴燒杯中，加入Trizol
試劑，將分散器頭垂直插入管內(nèi)與組織塊接觸，轉(zhuǎn)速12,000-20,000 rpm，上下移動試管10-20 次，直到組
織*打散，無肉眼可見大塊。用超聲儀：根據(jù)機器型號進行預試驗，選取能有效破碎組織的功率和時間。
注意：(1)由于Trizol 的性能，通常用50-100 mg 組織可獲得足量的RNA，對絕大多數(shù)實驗目的綽綽有
余。加入過量組織或過少Trizol 容易導致提取失敗。(2)少量難以打碎的組織碎片不影響后續(xù)RNA 提取。(3)
用研缽和玻璃勻漿器勻漿破碎組織時，應略微多加一些裂解液，以補充裂解產(chǎn)物粘在容器壁上造成的體積丟
失。
(2) 培養(yǎng)細胞。貼壁細胞：棄培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液沖洗細胞一次。每5-10?106 個細胞加1 ml Trizol
試劑，但Trizol 加入量必須有效地覆蓋瓶皿的細胞表面。一個75 cm2 瓶皿的細胞通常需要2 ml 提取液，
一個35 cm2 瓶皿的細胞需要1 ml 提取液，更小的培養(yǎng)瓶皿可使用更少的提取液，但后續(xù)操作會因體積過小
而極為不便?；蝿踊蛴梦^吹打使提取液流過并裂解所有細胞。置冰上5 分鐘，傾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚
于一處以便取出。懸浮細胞：低速離心收集細胞，將細胞快速重懸于50-100?l 的PBS 或去離子水中，每
5-10?106 細胞加1 ml Trizol 裂解。注意直接裂解未重懸的細胞沉淀，裂解物將十分粘稠而難以分散。細菌
酵母：離心收集沉淀，加入50-100?l 去離子水重懸細胞。每107 細胞加入1-2 ml Trizol 直接裂解。某些
細菌和酵母細胞可能需要勻漿破碎。
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(3) 液體標本：如體液、尿液、全血。每100?l 液體樣品加1 ml Trizol，置冰上1-3 分鐘。未抗凝
的凝固血液按固體組織處理。Trizol Liq (Cat# R1020)產(chǎn)品專門用于液體標本RNA 提取。
2. 將組織細胞裂解物轉(zhuǎn)移到1.5 ml 離心管，置冰上10 分鐘。
優(yōu)化步驟：如果組織裂解物含較多的碎片，或提取植物組織，12,000g 4 oC 離心10 分鐘，取上層裂解液，
棄管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪組織，12,000g 4 oC 離心10 分鐘，小心吸掉zui上面的油層，棄去。
再取裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如帶少量油滴不影響提取。
3. 加入0.2 體積的氯仿(0.2ml)，充分顛倒混勻，冰上孵育1-5 分鐘，溶液開始分相。有時分相不明顯，
不影響提取。
4. 離心12,000 ? g 4 oC 10 分鐘，溶液分為兩相。RNA 在上層水相，下層為有機相，兩相界面是一層薄膜
其厚度與組織細胞類型和多少有關(guān)。小心吸出0.5ml 上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管。
注意：取上清液時應保留0.5-1 mm 厚的水相，以免擾動和吸入下面的碎片和有機相。如果吸入，應
將所取的上清液放回管中并重新離心10 分鐘，再次吸取水相。這一點至關(guān)重要，違背此原則容易
導致RNA 降解和DNA 污染。如需同時提取DNA 或蛋白質(zhì)，則保留中間相和下層有機相，向公司
索要操作方法。
5. 加入等體積異丙醇(0.5ml)于上清液充分混勻。冰上孵育10 分鐘沉淀RNA。用更低的溫度和更長的時間
進行沉淀并不必要。如果起始組織細胞的量很少，－20 oC 放置一至數(shù)小時可沉淀幾乎所有的RNA。
注意：從富含多糖的植物組織或富含糖原的動物肝臟組織提取RNA 時，按以下步驟進行：以每1 ml Trizol
裂解組織，加氯仿后離心得到約0.5 ml 上清液計算，分別加入上清液一半體積即0.25 ml 的高鹽溶液(0.8
M 檸檬酸鈉和1.2 M NaCl)和0.25 ml 異丙醇，混勻。執(zhí)行下面的離心沉淀步驟6。離心后可有效沉淀RNA，
但多糖或糖原存留在上清可被棄去。從富含多糖的植物和動物肝臟組織提取RNA 時，推薦使用植物RNA 分離
試劑Plant Trizol 或Plant RNA Extraction Kit。
6. 12,000 g，4 oC 離心10 分鐘。管底可見少許RNA 沉淀。
注意：如初始組織細胞量少，RNA 將附著在管壁，用肉眼幾乎難辨沉淀，但不影響實驗。如RNA 沉淀量很多
并呈膠凍狀，通常表明有蛋白污染。應仔細檢查操作步驟。
7. 棄上清。立即加入1 ml 75%乙醇，顛倒混勻數(shù)次洗滌沉淀。12,000 g 離心5 分鐘。棄上清，盡量*
吸去管壁上的液體。
注意：乙醇洗滌后RNA 沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA 沉淀。RNA 沉淀在75%乙醇中可在4 oC
保存一周或在－20 oC 保存一年。
8. 敞開管口，空氣干燥5-10 分鐘使殘留液體揮發(fā)，RNA 略微沉淀干燥即可。用50-100 ?l 自備的DEPC 處
理的高壓消毒純水或TE 溶解沉淀。RNA 溶液可保存于－70 oC 或液氮中。
注意：過分干燥將使RNA 難以溶解。55 oC 加熱或反復凍融數(shù)次可以助溶。RNA 溶液加3 倍體積乙醇凍存于
－20 oC，用時離心沉淀。
說明：
1. 每100 mg 組織RNA 預期得率為：肝脾60－100 ?g, 腎50 ?g, 腦組織10-15 ?g, 胎盤20－40 ?g, 脂
肪50 ?g。1 x 107 個細胞通常得50－100 ?g。
2. 測定OD 值，根據(jù)OD260 計算RNA 濃度。OD260/280 比值可初步判斷RNA 質(zhì)量，比值在1.6-2.0 之間均
屬正常。起始組織量過大，或吸取了有機相或碎片，將使RNA 樣品中蛋白和雜質(zhì)含量高，RNA 沉淀乙醇
洗滌不充分(步驟8)，均可導致OD260/280 比值降低。例如，RNA 用水溶解或pH 偏酸OD260/280 偏低，
用TE 或離子強度較高的溶液溶解時較高，但均不影響RNA 后續(xù)使用。切記即便是已降解的RNA，
OD260/280 比值也能達到看似的2.0 左右，因此該比值并非判斷RNA 降解與否*的指標。判斷RNA
質(zhì)量的*途徑是進行普通RNA 瓊脂糖電泳檢查RNA 完整性。
3. 檢查RNA 完整性。取1 ?g RNA 樣品進行1%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。28S RNA~5
kb 亮度應該約為18S RNA~2 kb 的兩倍，有時可見0.1-0.3 kb 的5S RNA。
4. 調(diào)整RNA 溶液的體積或重沉淀RNA。(1) 加入適量DEPC 處理過的高壓消毒純水或TE 緩沖液，于RNA 溶
液中，使溶液體積補齊到約400 ?l；(2) 加入0.1 體積的3M 醋酸鈉pH 5.2，混勻；(3) 加入2.5
體積的純乙醇，混勻；(4) 冰上孵育10 分鐘；(5) 12,000g 4 oC 離心10 分鐘，棄上清；(6) 執(zhí)行上
述RNA 提取程序的步驟6－8。
5. Trizol 勿直接接觸皮膚和吸入。如接觸皮膚，立即用大量水清洗。