3操作技術(shù) 
　　操作過程的控制：①嚴(yán)格按照試劑說明操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60 min。②加樣后及時放入孵箱。標(biāo)本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。③封板溫育時，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“盎”灞的出現(xiàn)。④用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干；還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象。⑤合理安排檢測量，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。⑥加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干。⑦顯色劑盡量在臨用前配制，不使用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)的TM顯色劑不用。⑧加樣時保持顯色劑不外流；A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時要避免產(chǎn)生氣泡。⑨應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔，整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸。以上的措施可以得到更準(zhǔn)確、更可靠的實驗結(jié)果。加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性直接影響檢測結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。 
　　溫浴影響。在建立ELISA方法時做反應(yīng)動力學(xué)研究。實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2 h，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。反應(yīng)板孔、反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。溫育的溫度和時間應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定控制，特別要注意邊緣位置。96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別，易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周邊孔與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。 
　　洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELISA應(yīng)是靠洗滌來達(dá)到分離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固體相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎隨意。

　　洗滌液多為含非離子性洗滌劑中的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，又含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)恢復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度為0.005%～0.02%，高于0.02%可使包被在固相上的抗原或抗體借吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導(dǎo)率小于1.5 μs/cm，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其溶解后配制。手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大。半自動與全自動洗板機使用不當(dāng)也會影響結(jié)果，血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不*，導(dǎo)致“花板”，造成假陽性或假陰性。所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應(yīng)用去離子水清洗幾遍。 
　　保證洗板浸泡時間為40 s左右，孔內(nèi)液體被洗板機洗得越干凈越好。 
　　4顯色和比色 
　　TMB經(jīng)HRP作用后，約40 min顯色達(dá)，隨即逐漸減弱，至2 h后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮納和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時間（12～14 h）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色，此時可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、度和可測范圍、線性等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001，使用前先預(yù)熱儀器15～30 min，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。 
　　測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492 nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長（W1），第二在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置，zui終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 
　　肉眼判斷結(jié)果時，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須使用酶標(biāo)儀檢測，以保結(jié)果一致性。 
　　5 HOOK效應(yīng) 
　　隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標(biāo)本中抗原含量過高，產(chǎn)生HOOK效應(yīng)。影響檢測結(jié)果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減少HOOK反應(yīng)的發(fā)生。 
　　6干擾物質(zhì) 
　　有人認(rèn)為大約40%的科研血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)原性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的Fc段結(jié)合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標(biāo)二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃ 30 min滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦）在儲存過程中可能形成二聚體，會導(dǎo)致本底過深，影響檢測結(jié)果。 
　　7藥物的影響 
　　價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)。如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200 mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出，而且其所生的新生兒常出現(xiàn)HBsAg陰性、HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式，可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體與通過胎盤進(jìn)入胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物，則新生兒HBsAg檢測呈陰性，用0.5 mol的鹽酸處理標(biāo)本1 h可提高檢出率。 
　　為預(yù)防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的12周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成分，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗的主要成分HBsAg，有方法能夠把它檢出，如電化學(xué)發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應(yīng)做HBsAg檢測。 
　　8 抗原自身因素 
　　融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響以丙肝診斷試劑盒為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達(dá)載體的一些序列，可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。 
　　少數(shù)HBV感染后外周血中不含HBsAg。HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量為5 μg/ml～600 μg/ml。據(jù)文獻(xiàn)報道，到目前為止在獻(xiàn)血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg攜帶者zui低含量為0.2 ng/ml，含量高者可達(dá)2 000 μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細(xì)胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構(gòu)成病毒外膜，根據(jù)所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs應(yīng)答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變，使機體產(chǎn)生的抗體對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現(xiàn)HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預(yù)防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發(fā)生在多個部位，而且?guī)滋幫蛔兛赏瑫r存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續(xù)存在。zui近，有研究表明，前S1區(qū)丟失突變（氨基酸58～118）是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位于前S1，是合成HBsAg的調(diào)節(jié)元件，前S1的丟失突變則會影響S啟動子的功能，進(jìn)而影響HBsAg的合成。 
　　總之，的試劑、狀態(tài)良好的儀器、排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。