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上海信帆生物:重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

更新時間:2016-04-26      瀏覽次數(shù):1543

一、實驗目的 1、學習克隆工作中zui常用的雙酶切; 2、學習將外源基因與質(zhì)粒連接方法及操作技術; 3、學習氯化鈣法制備大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)細胞的技術; 4、了解細胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學研究中的意義。 5、外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細胞的技術以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術。 6、學習鑒定重組子的方法。 二、 實驗原理 重組子的建立:采用雙酶切質(zhì)粒載體pBR322和pUC18,酶切后產(chǎn)生了互補的粘性末端,在T4 DNA 連接酶的作用下,兩個質(zhì)粒片段連接。 感受態(tài)細胞(Competent cells):受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生變化,成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competent cell) 。
??? 轉(zhuǎn)化(transformation):是將異源DNA分子引入一細胞株系,使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,是基因工程(Genetic Engineering)等研究領域的基本實驗技術。 電轉(zhuǎn)化法:使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。 克隆的篩選:主要用不同抗生素(antibiotic)基因篩選。常用的抗生素(antibiotic)有:氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等; 重組質(zhì)??寺〉蔫b定:鑒定帶有重組質(zhì)??寺〉姆椒ǔS玫挠?alpha;-互補、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。zui常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進行酶切分析,對于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合α-互補現(xiàn)象來篩選。 三、試劑與器材 1、試劑 pUC18質(zhì)粒,pBR322質(zhì)粒,DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩沖液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩沖液,DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa),LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ,LB固體培養(yǎng)基,50mg/ml卡那霉素(kanamycin)儲存液,質(zhì)??焖偬崛≡噭┖校ú┐筇┛耍?,10 X Buffer K, Pst I,EcoR I (TaKaRa) 2、器材 電基因轉(zhuǎn)移議,恒溫搖床,臺式高速離心機,恒溫水浴鍋, 瓊脂糖凝膠電泳裝置,電熱恒溫培養(yǎng)箱,電泳儀超凈工作臺, 微量移液槍,eppendorf管。 四、操作方法 1.構(gòu)建重組質(zhì)粒 質(zhì)粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切,將酶切產(chǎn)物按照1:1的比例混合,使用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒。 2.制備感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)細胞 收集大腸桿菌(Escherichia coli)細胞,采用CaCl2 處理,制備成感受態(tài)細胞。 3.重組子的轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒加入到制備的感受態(tài)細胞懸浮液中,電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。 4.重組子的篩選鑒定 采用藍白篩選重組子。酚/氯仿快速抽提質(zhì)粒,酶切后電泳鑒定。 ?五、關鍵步驟與注意事項 2.連接反應溫度選擇要適中,過高粘末端之間形成氫鍵不穩(wěn)定,過低會影響連接酶的活性。 3.連接反應兩種質(zhì)粒的比例為1:1,否則容易自連。 4.制備感受態(tài)細胞時要采用對數(shù)生長期初期的細胞,低溫處理時間要足夠。 5.電擊法時電擊電壓、電流、時間選擇要合適。 6.轉(zhuǎn)化及藍白篩選要作陰、陽性對照,防止出現(xiàn)假陽性、假陰性。

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