信帆生物分享：WB實驗常見的問題指南

1. 參考書推薦

A. 對初學者看什么資料比較好?解答：《抗體技術實驗指南》和Antibodies(a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane)兩本書不錯。

2. 針對樣品的常見問題

B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot (以下簡寫成Western Blot)，提取線粒體后凍存(未加蛋白酶抑制劑)，用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

解答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復凍融;2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

C. 同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?

解答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

D. 如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么?

解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

E 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決?

解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，多加5-10%甲醇。

F. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?

解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6%， Stacking Gel 3.5%。

G. 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量?如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。

解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30%是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb。

H. 蛋白變性后可以存放多久?

解答：-80℃，一兩年沒有問題。zui關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。

I. 我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方，不知為何?

解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置。

J. 接下來我準備采用DAB顯色技術，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎?

解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用BSA代替應該好一點.

K. 還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎?

解答：Western Blot一般上樣30-100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。