一、 前 言
近二十幾年來，免疫學分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標記了的抗原和抗體的分析技術以后，使原來許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫（RIA）分析技術之后，在70年代初期又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術。由于酶的生物催化作用，一個酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個底物分子發(fā)生反應，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相繼分別報道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。
ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現(xiàn)已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于研究標本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學各領域的應用范圍日益擴大，可概括四個方面：
1、免疫酶染色各種細胞內(nèi)成份的定位。
2、研究抗酶抗體的合成。
3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應。
4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。
二、方法的基本原理和種類
ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學活性；
（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；
（3）酶結合物與相應抗原或抗體結合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。
由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應，產(chǎn)生放大作用，正因為此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。常用的ELISA有以下兩個方面。
（一）測定抗原的，主要有四種方法。
1、競爭法（Competition method）:方法的基本原理可見圖1：本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個過程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量。
這種方法所測定的抗原只要有一個結合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。該法的優(yōu)點是快，因為只有一個保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標記抗原為其缺點。
圖1：竟爭法測抗原示意圖
2、雙抗體夾心法
方法的基本原理可用圖2來表示
圖2.雙抗體夾心法測抗原示意圖
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。
3、改良雙抗體夾心法：本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用于測定抗原的，其原理可用圖3來表示。
圖3.改良雙抗體夾心法測抗原示意圖
本法首先是將特異性抗體a包被于固相載體，經(jīng)洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經(jīng)孵育洗滌后再加一次未標記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b于*次包被于固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應。經(jīng)孵育洗滌后，再加酶標記抗b抗體，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色進行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數(shù)更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時避免標記特異性抗體，而另一優(yōu)點是只要標記一種抗抗體，即可達到多種應用。
用于測定抗原的尚有第4種叫做抑制性測定法（見圖4），它是先用抗原包被固相載體，然后分為二組，一組加入用參考抗體和被檢標本混合孵育后的混合溶液，假如標本中不含抗原，則參考抗體未被結合。因此它可以和包被于固相載體上的抗原結合。如標本中含有抗原，則抗原先與參考抗體結合，故參考抗體不再與包被于固相載體上的抗原結合。對加入酶結合物（抗球蛋白）和底物僅顯示剩余結合的抗體量。再與另一組不加待檢標本的參考系統(tǒng)比較，被檢標本對底物顯色的抑制程度與標本中所含抗原量成比例，二者之差，即為欲測抗原的量。
圖4.抑制性測定法的原理
被檢標本對底物顯色的抑制程度與標本中所含抗原的量成比例，二者之差即為欲測抗原的量。
（二）測定抗體方面：所用的方法稱為間接法，也是目前zui常用的方法，其原理可用圖5來表示。
圖5.間接法測抗體示意圖
間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測抗體之標本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標記抗抗體，（對人的標本來說即加酶標抗人球蛋白IgG、IgM），再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學診斷。如用酶標記抗人IgM,則可用于早期診斷。
三、ELISA的影響因素
這是ELISA檢測中的重要部分，可從9個方面加以說明。
（一）固相載體：可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。由于微量反應板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應用。國產(chǎn)聚苯乙烯微量反應板（上海塑料三廠出品）目前已大量應用于ELISA測定，并且獲得了滿意的結果。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質(zhì)有關。特別是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至*喪失吸附能力。因此，對每批制品在使用前，必須經(jīng)過實驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板或塑料管抽樣，用0.2ug/ml純化的正常人IgG進行包被，經(jīng)洗滌后加酶標記抗人球蛋白進行反應，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應后，逐孔在酶標比色計中測定其消光值、光密度（O.D值）。一般認為全板中每兩孔間O.D值的誤差不超過10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應板或塑料管在使用前并不一定通過特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應用。
（二）抗原：在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。經(jīng)試驗證明，適用于其他血清學試驗的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的抗原。對大多數(shù)傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細菌的外毒素以及用表面活性劑（如SDS）所提取的抗原等，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。此外，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性。用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟，而且可以克服前帶現(xiàn)象。那么用多大濃度抗原進行包被zui為合適呢？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結合物進行反應，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別。抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用
PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應通過滴定。
（三）試驗樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標本）。但應注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關于科研血清在保存過程中抗體的穩(wěn)定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標本，可用含保護性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進行孵育。此種被試標本可作一系列稀釋度測定，也可用一個稀釋度測定。對于作某一個傳染病的診斷來說，先用一系列稀釋度作一批標本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度（即測定劑量反應曲線），然后用一個稀釋測定即可。zui適稀釋度和孵育時間均需從實踐中摸索出來，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學診斷，以1：200稀釋度測定比較適當，而試驗標本的（即含抗體）作用時間一般為室溫或37℃ 1-2小時。但現(xiàn)在對有些標本（如流腦抗原）測定時，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。
（四）結合物：在ELISA中，用酶標記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結合物，此為進行ELISA檢測的關鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結合物，而此種制備好的酶結合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低。
用什么樣的酶來標記抗原或抗體呢？可根據(jù)以下幾點來選擇適當?shù)拿浮?/span>
1、酶制品的純度及活力高，催化效力也高，放大倍數(shù)大（即一個酶分子能催化幾十幾百個底物分子發(fā)生反應的酶）。
2、酶及制備好的酶結合物在檢測或貯存中能保持穩(wěn)定。
3、酶制劑易得、價廉.
4、既要適用于標記抗原，又適用于標記抗體，標記后不影響抗原或抗體的免疫學特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反應產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測時簡便、快速。在定量測定中產(chǎn)物必須是可溶性的。
6、要有安全、價廉、易得的底物。
符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為5×105（Alkaline Phospatase,簡稱AP），辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,簡稱HRP,分子量為4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種（AP和HRP）zui為常用。
AP活力高，制備好的酶結合物可加NaN3防腐，但此種酶不易獲得，因其是從小牛腸粘膜中或大腸桿菌中提取，而且價格比較昂貴。因此，目前國內(nèi)外大多使用HRP。HRP活性也高，價格較便宜。但制得酶結合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低溫保存或加60%緩沖甘油等量混合后少量分裝，保存冰箱，一般可用1-2年。
由于HRPzui為常用，故先把HRP的一般性質(zhì)介紹一下，以便在制備酶結合物時可引起注意。
（HRP的性質(zhì)）:HRP系從辣根菜的根中所提取，這種酶是無色酶蛋白與暗棕色的鐵卟
NH2
啉（E鐵血素）相結合的一種醣蛋白，可簡寫成Fe-E ，由多個（6-7個）同功
CH2OH
酶所組成。分子量約為40000，等電點為PH7.2。能被58-62%飽和硫酸銨沉淀，在PH3.5-12均較穩(wěn)定。63℃15分鐘，室溫數(shù)周、甲苯和其他苯類有機溶劑處理都不影響它的活性。
由于HRP中的酶蛋白和鐵卟啉分別在波長280nm和403nm有二個zui大吸收峰，其兩者的比值，即O.D403nm/O.D280nm稱為RZ值（系由德文Reinnoit-Zah）而來，表示酶的純度。高純度酶制品RZ值可達3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高達75%。不適合作ELISA用，經(jīng)純化后才能應用。目前我們國產(chǎn)的HRP RZ值達2.5-3.0，亦可作ELISA用。
抗體：制備酶結合物的抗體要提純。被標記的抗體要求效價及親和力都要高，因為純化抗體可增加反應的特異性。如果采用級特異性的酶結合物（例如酶標抗IgM、酶標抗IgG）。有助于區(qū)別活動性感染（早期診斷）和已過性感染（追朔診斷）。但在大多數(shù)情況下，用抗血清中的蛋白成份與酶結合所制成的結合物亦可應用，而且相當穩(wěn)定。其方法是用硫酸銨沉淀抗血清三次（50%飽和的1次，33%飽和的2次），經(jīng)透析除鹽，即可用于標記?；蛘呓?jīng)DEAE-纖維素柱層析后所制成的IgG亦可標記。如將IgG再通過葡聚糖凝膠G-200膠濾（用PH7.2 PBS洗脫）所得純化IgG用HRP標記則更佳。但損失較大，也有人用親和層析法提純抗體來標記的。但在用酶來標記抗體前，需測定一下抗體球蛋白效價和蛋白含量。一般用Beutner氏瓊脂糖散法測效價（即玻片雙相瓊脂擴散法），中央孔加1mg/ml抗原，周圍孔加不同稀釋度粗制或提純抗體（馬或羊抗人IgG），室溫擴散24小時，沉淀反應效價達到1：16以上者即可應用。而蛋白質(zhì)含量可用751紫外線分光光度計測定，也可用Folin酚法測定。
結合：用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結合起來呢？當然不能用強烈的方法，因為強烈的方法會使酶和抗體失去活性。故只能用溫和的方法把酶和抗體結合起來。因此，必須使用結合劑。理想的結合劑應具備下列條件：（1）不影響酶及抗體活性，（2）不產(chǎn)生干擾物質(zhì)，（3）抗體和酶結合后應有較高的產(chǎn)量，（4）不出現(xiàn)非特異性反應,（5）結合程序簡便，（6）來源易、價廉。目前常用的有戊二醛和過碘酸鈉二種。由于對所使用結合劑的針對性，因此標記的方法也有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鈉氧化法兩類。
1、戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種能使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)聯(lián)結zui常用的雙功能試劑。它有2個對稱的活性醛基，可分別與酶蛋白和免疫球蛋白上的游離氨基（酚基、味唑基、巰基）以共價鍵邊接起來而形成的酶結合物。例如酶（Fe-E-NH2CH2OH，）通過戊二醛與免疫球蛋白（Ig-NH2）的交聯(lián)反應式如下：
NH2 H H
Fe-E + OHC-（CH2）3-CHO + H2N-Ig--> Fe-E-N=C-（CH2）3-C=N-Ig+2H2O
CH2OH CH2OH
酶 低聚醣基團 戊二醛 免疫球蛋白 酶結合物 水
用戊二醛標記又可分為一步法和二步法。一步法主要是將酶、抗體球蛋白和戊二醛同時混合而直接制備。此法雖然簡單，但因酶蛋白的活性氨基少，免疫球蛋白的活性氨基多，在戊二醛作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物，當然也可形成酶蛋白的聚合物。因而，形成酶標記抗體的比例較少，同時抗體和酶的活性喪失較多，結合物的酶活性較低，但較簡便。戊二醛二步法中先用過量的戊二醛與酶作用，使戊二醛上的一個活性醛基先與酶蛋白上的一個氨基結合后，除去過量戊二醛（可通過葡聚糖凝膠G-25過柱或用透析法除去），然后，再加入抗體球蛋白，使之與酶--戊二醛復合物反應，形成酶結合物。而酶結合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如賴氨酸除去，于穩(wěn)定酶結合物的特異性。在戊二醛二步法中，酶本身并不產(chǎn)生縮合，因為在第二步酶分子上的一個游離氨基僅與戊二醛上的一個活性醛基聯(lián)結，而戊二醛上另一個活性醛基則可與第二步加入的抗體球蛋白分子上的氨基結合生成酶結合物，因此，兩步法優(yōu)點是能生成均一的酶結合物，大多可使一個分子酶與一個分子球蛋白作用，抗體和酶的活性損失較少，所得酶結合物活性比一步法高10倍左右。
其方法是將10mg HRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH 6.8 0.1mol/L PBS中，置室溫18小時，充分透析或經(jīng)葡聚糖凝膠G-25層析除去多余戊二醛，加生理鹽水至1ml，然后加入5mg純化的抗體球蛋白及0.1ml PH 9.6的1 mol/L碳酸鹽緩沖液，混合后于4℃冰箱放置24小時，加入0.1ml 0.2 mol/L的賴氨酸溶液，室溫置2小時，用PH 7.2、0.15 mol/L PBS充分透析，藉離心除去沉淀，上清即為酶結合物。必要時可作進一步純化后使用。
2、過碘酸鈉氧化法：本法是目前酶標記抗體較好的方法，能使70%酶與90%以上球蛋白結合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯，F(xiàn)DNB）封閉HRP表面的游離氨基（亦可用甲醛或戊二醛來封閉），從而提高酶結合抗體球蛋白的能力，避免酶的自身交聯(lián)。然后用過碘酸鈉來氧化HRP表面結構的醣鏈部份（即低聚醣基團）使成醛基，使其直接與抗體球蛋白上的游離氨基形成共價鍵而結合。zui后用硼氫酸鈉還原，使HRP表面醛基能充分與抗體球蛋白上氨基進行反應，使之形成穩(wěn)定的結合物。其反應式如下:
NH2 N=CH2
（1） Fe—E +HCHO----> Fe—E +H2O
CH2OH CH2OH
N=CH2 NaIO4 N=CH2
（2） Fe—E +O---->Fe— E + H2O
CH2OH CHO
N=CH2 N= CH2
（3） Fe—E +H2N-Ig---> Fe—E + H2O
CHO C=N-Ig
H
其標記步驟是：10mg HRP溶于新鮮配制的0.3 mol/L PH 8.1碳酸氫鈉2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯無水乙醇溶液，室溫中攪拌1小時以封閉HRP表面的游離氨基。再加2ml 0.08 mol/L NaIO4水溶液，于室溫中輕攪30分鐘，用0.16 mol/L乙二醇溶液終止氧化反應。1小時后移入透析袋中置0.01 mol/L PH 9.5的碳酸鹽緩沖液中透析過夜，除去試劑，透析袋中的即為醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗體球蛋白（用2ml碳酸鹽緩沖液溶解），混勻，室溫攪拌2-3小時后加10mg硼氫酸鈉鹽，4℃冰箱4小時或過夜。次日取出加等量飽和硫酸銨沉淀酶結合物（去游離酶），并用50%飽和硫酸銨洗滌1-2次。再溶于3ml PH 7.4 PBS中，并置透析袋經(jīng)透析除鹽，如有沉淀藉離心除去。上清酶結合物加入等量60%甘油PBS，分裝保存，冰箱備用。
如采用改良過碘酸鈉簡化法制備酶結合物，比原法更簡便、快速，所獲制品質(zhì)量良好。其方法是取10mg HRP加1ml0.1 mol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻，約5分鐘后加0.08 mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱內(nèi)20分鐘，加0.4 mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應，30分鐘后加21% NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的無水乙醇（AR）沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇（盡量去除乙醇），沉淀用PH9.6的0.05 mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊或馬抗人IgG（內(nèi)含蛋白量20mg左右），攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mg NaBH4 混勻，3小時后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結合物，離心，去上清，沉淀用50%飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用0.01 mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理鹽水透析除鹽（需換液5次），如有沉淀藉離心除去，上清呈淡棕色即為酶結合物。加60%甘油PBS，分裝保存?zhèn)溆谩?/span>
制備好的酶結合物，要作兩者克分子比和使用稀釋度的測定，標記率的測定（A403/A280—0.4—1.0為宜）。
1、酶結合物克分子比測定：將制備好的酶結合物經(jīng)適當稀釋在分光光度計中以280nm和403nm測O.D值，然后按下列公式計算兩者的克分子比。
（1）酶戊二醛交聯(lián)法的計算：
酶量：mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4為酶O.D403nm=1.0時相當于0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62
其中O.D403nm×0.42為酶蛋白結合戊二醛后在280nm應有的O.D，抗體球蛋白0.62為蛋白質(zhì)與酶--戊二醛結合后O.D280nm值約應以加6%，故以0.94校正之。換算系數(shù)，故zui后要乘于0.62。
（2）用過碘酸納氧化法的計算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.3）×0.62
其中O.D403nm×0.3為酶蛋白本身在280nm應有的O.D值。
mg/ml（酶） mg/ml（球蛋白） mg（酶）×4 克分子比=---------- ÷---------------=--------------- 40000 160000 mg（球蛋白） |
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶結合物的克分子比。
一般要求制備好的酶結合物二者克分子比在0.8-1.2，但不能超過2或稍高。
2、酶結合物使用稀釋度測定：先將一定濃度的抗原（如為抗人酶結合物，則用1μg/ml正常人IgG）包被固相載體，洗滌后加一系列不同稀釋度之酶結合物進行孵育，洗滌加底物顯色，并終止反應。在酶標比色計中測定不同稀釋度酶結合物的O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個酶結合物稀釋度即為本批酶結合物的使用濃度，見表中約1：12000稀釋。
| 酶結合物稀釋度 | 1：3000 | 1：6000 | 1：9000 | 1：12000 | 1：15000 | 1：18000 |
| O.D值 | 2.45 | 1.96 | 1.59 | 1.12 | 0.74 | 0.405 |
（五）洗滌劑與稀釋劑：為了使特異性結合的抗體量盡可能多，包被微量反應板凹孔的抗原應該稍微過量。但在孵育或洗滌過程中，已吸附的抗原可能有部份會從固相載體上被洗滌下來。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會吸附到原來包被抗原凹孔的空白處,增加本底顏色,產(chǎn)生假陽性反應,這是限制ELISA特異性的一個因素.因此不少學者在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護性阻劑來抑制非特異性蛋白的競爭性吸附作用。已經(jīng)證明牛血清白蛋白（BSA）和吐溫—20有良好的封阻作用。其加入的量BSA為0.5%～1%；吐溫—20為0.05%。（有人曾經(jīng)比較了四種洗滌劑，結果認為蒸餾水加0.05%吐溫-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐溫-20都是良好的）。在一般的洗滌劑和稀釋劑中還加有NaN3防腐，但是用HRP制備酶結合物時則不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗滌劑或稀釋劑中雖可改善ELISA的結果觀察，但由于BSA比較昂貴，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗滌劑中加入0.1%白明膠，2%免血清，有利于加強封阻作用。zui近有人報告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl緩沖液中加入0.05%吐溫-20作洗滌劑，效果很好，被檢血清和酶結合物的稀釋劑，可與洗滌劑相同，但不需加0.2‰的KCl。
在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應，而且還可增加陽性標本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應用。（0.5 mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀釋劑中，可提高特異性。
（六）底物：各種酶都有對底物的特異性，所以使用不同種類的酶要求有不同的底物。一旦酶結合物已經(jīng)確定（如AP或HRP），那么可供選擇底物的范圍是很有限的。在這有限底物的范圍內(nèi)如何選擇合適的底物呢？應按下列幾個條件進行選擇。（1）底物在未被酶催化以前應該是無色的，而經(jīng)酶催化后有明顯的顏色變化，這樣可使結果分辨清楚；（2）所顯色澤易干洗脫；（3）顯色后的產(chǎn)物要求穩(wěn)定，在作定量測定時所產(chǎn)生的有色物質(zhì)應該是可溶性的；（4）價廉，易得而且無毒。
因此，對AP酶結合物來講，一般均用硝基苯磷酸鹽，顯色后呈桔黃色，色澤穩(wěn)定，用2 mol/L NaOH終止反應，可用波長403nm測定O.D值。AP催化底物產(chǎn)生顏色的反應如下：
O AP R—O--P—OH+H2O R—OH+H3PO4 OH 桔黃色 對硝基酚脂肪酸 對硝基酚 |
因AP是一種磷酸酯酶,它能催化磷酸酯（硝基苯磷酸鹽）水介釋放出無機磷酸而顯色。
對HRP酶結合物來說，主要通過酶的催化作用使過氧化氫還原。同時使另一個底物氧化產(chǎn)生色變，可供選擇的底物有幾種，過去都用5-氨基水楊酸，它經(jīng)酶催化后產(chǎn)生棕色產(chǎn)物便于觀察，缺點是容易產(chǎn)生沉淀，用于定量測定時有困難。目前大多數(shù)使用鄰苯二胺（Ortho-Pheny lene-diamine，簡稱OPD），穩(wěn)定、敏感，其降解產(chǎn)物呈桔紅色，可溶。用2 mol/L H2SO4或檸檬酸終止反應，可在492nm波長的酶標比色計上測定O.D值，也可目測。HRP在催化反應中可使H2O2分解出新生態(tài)氧，本身還原成水，而使OPD氧化生成有色產(chǎn)物，反應式如下：
NH2 NH NH NH2 HRP NH NH +H2O2-------> +2H2O O.P.D 桔紅色 |
O、P、D對光不穩(wěn)定，故加后需放暗處作用。但據(jù)報告有致突變性，
O.P.D對光不穩(wěn)定，故加后需放暗處作用，但據(jù)報告有致突變性，使時需注意。此外尚可選用鄰聯(lián)甲苯胺（Ortho-Toli dine，簡稱OT），顯色以后呈蘭色，可用波長630nm測O.D值，不需終止反應。也可用目測，但顯色后不穩(wěn)定，40分鐘色澤會自行減退，故需及時測定結果。加終止劑后呈現(xiàn)黃色，則需用波長405nm測定O.D值。
底物配制方法如下：
1、用O.P.D作底物：先配制PH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。取0.1 mol/L（19.2克/升），檸檬酸溶液24.3ml，加0.2 mol/L（27.4克/升）Na2HPO4溶液25.7ml，再加蒸餾水50ml，然后將40mgO.P.D溶解其中，再加30% H2O2 0.10ml即可應用，用時新鮮配制、避光。
2、用OT作底物，先配PH3.7的醋酸鹽緩沖液，取0.2M醋酸（12ml/升）和醋酸鈉（16.4克/升）溶液等量混和，然后稱取OT 21.2mg先溶于1ml二甲基乙酰胺中，再將OT溶液傾入100ml PH3.7的醋酸鹽緩沖液中，并加入30%H2O2 0.05ml即得，用前新鮮配制。
（七）作用時間：加底物后要多長時間終止反應測定結果呢？一般可采取二種方法。
1）任意確定一個時間，如20分鐘或30分鐘終止反應，測定被檢標本和陽性參考標本的O.D值。這樣所得的數(shù)據(jù)要進行校正，校正可按下列公式：
1.0 校正后O.D值=被檢標本的O.D值×------------------- 陽性標本的O.D值 |
2）制備好一批酶結合物后預試時間，在反應溫度固定時，當陽性參考血清O.D值達到1.0時終止反應，記錄這個時間，如30分鐘，以后用本批酶結合物測定待檢樣品時都采用同一時間終止反應，這個辦法不需要校正，比較方便。
國外在使用自動測定儀時，加底物后隨時測定，每塊試驗板上陽性參考血清的O.D值，當其達到1.0時，立即將全板上被試標本終止反應進行測定，這樣所得結果比較一致。我國也有自動酶標測定儀，但由于固相載體不夠均勻，也很難用板來直接測定。
在ELISA中所加酶結合物之濃度，加后孵育時間以及加底物后孵育時間。這三個因素也是互相有影響的。一般講，酶結合物濃度低，則要求孵育時間長些，而酶結合物濃度高則要求孵育時間短些，可根據(jù)實驗的具體情況，變更不同因素，以取得良好的結果。
由于ELISA中變異因素多，對于要診斷某一疾病時，必須進行一系列實驗室預試，摸索，或叫實驗研究，在酶結合物已經(jīng)確定的情況下，一般要求預測以下5個條件：
（1）抗原包被濃度；
（2）被檢血清稀釋度，即測劑量反應曲線；
（3）*抗體作用時間；
（4）酶結合物作用時間；
（5）底物作用時間。
一旦試驗條件摸清，以后在正式測定時，必須固定條件，不要隨時改變，以使試驗系統(tǒng)保持足夠的穩(wěn)定性。
（八）結果判斷:ELISA的試驗結果可用肉眼觀察顏色反應的深淺作出判斷，也可用分光光度計作測定。當然,后者更為正確。而肉眼觀察更為簡便，而且也有一定正確性。據(jù)Adler（1980）報告,目測為±1+、2+、3+、4+相當于分光光度計測定O.D值。
不論用哪種方法判定結果，每次都要有陽性和陰性參考血清作對照，這樣可以消除一些外界的影響因素。
≤0.04“±” 0.06～0.092和0.08～0.25“+”
0.26～0.5“++” 0.51～1.0“+++” > 1.0“++++”
（九）試驗的重復性（度），有二種方法來檢驗試驗的度：通常用變異系數(shù)來表示：1、幾個樣品用ELISA法同時進行多次測定求出CV%；2、不同時間對不同操作者對某幾個樣進行多次測定求出變異系數(shù)。CV是個體參數(shù)標準差與平均數(shù)的比率。
S / X ＝ CV ，CV應低10%，不應大于10～15%。
不論目測或分光光度計測定，均可作一個稀釋度或一系列稀釋度測定，一般常規(guī)診斷只用一個稀釋度判斷陽性或陰性就可以了，這樣比較方便，現(xiàn)在推薦傳染病的血清診斷用1：200一個稀釋度。有些需要定量的，可作一系列稀釋度測定。
記錄結果有下列幾種方法：
1、“+”或“-”：所有超過規(guī)定的O.D值（如O.D，0.4）的標本均屬陽性，此規(guī)定O.D值是根據(jù)事先測定大量陰性標本所取得的，此規(guī)定值是陰性標本的上限。或者以一組陰性標本O.D平均值加2～3個標準差作為陽性閾值。
2、直接以O.D值來表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，陽性反應越強，但此數(shù)值是在固定實驗條件下得到的結果，而且每次實驗都要有參考標本作對照。
3、以終點滴度表示：將標本作連續(xù)稀釋，zui高稀釋度能出現(xiàn)陽性反應者（即OD值仍大于陽性閾值，即為該標本的滴度。
4、以“比值”表示：求出被檢標本的O.D值與一組陰性標本O.D值的比值，例如為陰性標本的2倍或3倍，即為陽性，比值小于2.1而大于1.5為可疑，<1.5為陰性。
測定標本O.D值-空白O.D值
—————————————≥2.1
陰性對照O.D值-空白O.D值
如在此測定時以空白校正“O”點。
5、以“單位”來表示：在測定被檢標本的同時，再測定一個含已知單位數(shù)的陽性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢測后，以O.D值為縱坐標，單位數(shù)為橫坐標，畫出標準曲線。以后可根據(jù)被檢標本的O.D值，從曲線上找出相應的單位數(shù)，再乘于血清的稀釋倍數(shù)，即可得出被檢標本的單位數(shù)。
作試驗時的陰性參考血清不要顯色，否則會對結果判斷帶來困難，特別在目測時，當陽性標本O.D值>2.0時，應作適當稀釋后再作測定。
（十）對使用儀器要求：所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用于酶結合和底物的吸管和容器一定要分開。試劑要求標準化。
四、具體操作法
上面已經(jīng)把ELISA中各步驟的影響因素作了說明，為了便于工作下面把ELISA的操作程序列于表1供參考：
表1：ELISA操作步驟
| 方法 步驟 | 間接法（測抗體） | 雙抗體夾心法 （測抗原） | 競爭法（測抗原） | 抑制性測定法 |
| 1 | 包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至zui適濃度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反應板每個凹孔中,4℃過夜或37℃水浴2～3小時,貯存冰箱 | 包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至zui適濃度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱 | 包被特異性抗體： 同左 | 包被抗原： 同左 |
| 2 | 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 3 | 加被檢標本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0.2ml，37℃，作用1～2小時 | 每凹孔加入0.2ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本，37℃作用1～2小時。 | 分2組,a組加酶標記抗原和被檢抗原混合液0.2ml，另一組只加酶標記抗原液0.2ml，37℃作用1～2小時。（混合液可作成不同稀釋度）。 | a組加參考抗體和被檢抗原混合液0.2ml，另一組加參考抗體與等量稀釋劑0.2ml，37℃作用1～2小時。 |
| 4 | 洗滌：重復2 | 同左 | 洗滌：同左 | 洗滌 |
| 5 | 加入酶結合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結合物0.2ml 37℃作用1～2小時 | 加入0.2ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時或由預試實驗確定作用時間。 | | 各加入0.2ml抗參考抗體的酶結合物37℃作用1～2小時 |
| 方法 步驟 | 間接法（測抗體） | 雙抗體夾心法 （測抗原） | 競爭法（測抗原） | 抑制性測定法 |
| 6 | 洗滌：重復2 | 同左 | | 洗滌 |
| 7 | 加入0.2ml底物溶液于每個凹孔,（O.P.D或O.T），室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4ml底物加0.1ml終止劑）。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 8 | 加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2M檸檬酸0.05ml。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 9 | 觀察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（O.P.D用492nm）O.D值。 | 同左 | 用酶標比色計測定a、b兩組O.D值，并求出a、b、O.D值的差數(shù) | 同左 |
五、ELISA的應用
ELISA應用的范圍很廣，而且正在不斷地擴大，原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。酶免疫試驗（EIA）結合光學顯微鏡或電子顯微鏡可進行抗原定位與結構的研究，用酶標記抗原或抗體結合免疫擴散及免疫電泳可提高試驗的敏感性。在實際應用方面可作疾病的研究診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。因此，它和生物化學、免疫學、微生物學、藥理學、流行病學及傳染病學等方面密切相關。
檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當，在血液學方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細胞抗原及結合球蛋白（Hapto Globin）等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），對前者的敏感性已達到與放射免疫試驗相當?shù)乃?，但對CEA檢查的敏感性較低，目前尚不能用于常規(guī)診斷,在傳染病的診斷方面正在日益擴大，其中zui滿意的是用于檢查乙型肝炎表面抗原。國內(nèi)外已有ELISA檢測的商品供應。尚有用于檢查霍亂弧菌、大腸肝菌、綠膿桿菌和破傷風梭菌毒素；腦膜炎球菌及淋球菌抗原；檢查免疫抑制樣本中常見的白色念殊菌抗原，檢查樣本或病獸的糞便中的輪狀病毒，自樣本標本中檢查甲肝病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨細胞病毒等。還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用于測鉤體抗原及血吸蟲病的循環(huán)抗原等。在免疫化學方面可用于檢測白蛋白，免疫球蛋白的各種組份，也可用于檢測補體成份，如：ciq，還能用于檢測蛇毒。
檢查抗體方面：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對多種傳染病和寄生蟲病的血清學診斷，亦開始廣泛用于現(xiàn)場流行病學調(diào)查。在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學診斷，這對人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、結核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用于破傷風抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測定以及檢測斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗體，可作診斷。對立克次氏體還可用以鑒別密切有關的種屬。也有用于檢查鸚鵡熱衣原體抗體的報導。試用于病毒抗體檢查報告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其敏感性都超過目前常用的檢查方法。此外，還可用于鑒定病毒型別，例如皰疹病毒。如能進一步改進方法用于檢查特異性IgM，可以作為早期診斷以及了解體內(nèi)有關抗原的清除情況。在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測定以及對過敏的診斷，例如檢測各種過敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。在衛(wèi)生學方面，可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。
六、ELISA存在的問題
從以上的簡單介紹中可以看出，ELISA法由于本身所具備的*性，是一項很有發(fā)展前途的血清學診斷方法，而且應用的領域也越來越廣泛。但是我們認為ELISA不是萬應良方，用它來代替一切，這是不當?shù)摹Ｒ驗镋LISA法還有局限性：
1、由于ELISA所用的抗原大部分還是混合的可溶性抗原，所以對同一微生物寄生蟲或其他物質(zhì)不同部位的抗原還沒有分開。
2、內(nèi)源性過氧化酶的普遍存在，如人腦組織中，呼吸道分泌物的炎癥細胞中及某些病毒的組織培養(yǎng)中均有內(nèi)源性過氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去時，則病毒的抗原性亦受到破壞，對于用ELISA檢測不利。
3、對ELISA法的非特異性評價的資料尚不夠完善，因此，對出現(xiàn)一些非特異性反應的時候，往往不易解釋。
4、固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還不一致，致使不同批號的固相載體有時本底值較高，有時吸附性能很差，影響試驗結果。
5、試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過海，各顯神通”，標準還不能統(tǒng)一。
下面將ELISA法與免疫熒光（IFA）和放射免疫（RIA）的各自優(yōu)缺點作一簡要的比較（表4）,供參考:
表4:三種方法的優(yōu)缺點比較:
| 方法種類 比較指標 | ELISA | RIA | IFA |
| 敏感性 | 高 | 高 | 較低 |
| 特異性 | 取決于抗原制備 | 同左 | 較高 |
| 重演性 | 尚滿意 | 尚滿意 | 尚滿意 |
| 結果判斷 | 客觀 | 客觀 | 有主觀因素 |
| 抗原制備 | 較容易或復雜 | 同左 | 較容易 |
| 結合物制備 | 正在標準化 | 已標準化 | 已標準化 |
| 在野外條件下用于大量人群標本的普查 | 可以 | 困難 | 尚可以 |
| 分析自動化 | 可以 | 可以 | 困難 |
| 主要設備 | 酶標比色計 | 粒子計數(shù)器 | 熒光顯微鏡 |
| 試驗成本 | 低 | 高 | 較高 |
| 試劑半衰期 | 長 | 短 | 長 |
| 對人的危害性 | 無或很少 | 有 | 無或很少 |
| 主要檢測對象 | 抗體或抗原 | 抗原 | 抗原或抗體 |
| 應用范圍 | 小的診斷實驗室 | 大的中心實驗室 | 小的診斷試驗室 |
綜上所述，ELISA在國內(nèi)外已使用得非常廣泛，但對該法在應用中的評價尚不一致，過去在ELISA法開始建立時有全面肯定的趨勢，而在廣泛研究和實踐中發(fā)現(xiàn)了一些缺點，遇到了一些困難，如在重演性問題、特異性問題以及能否考核療效問題等等。所以在70年代末期也有人采取否定的態(tài)度，全面肯定或全盤否定，這些都是不正確的，對一種新方法的建立和深入研究，要采取一分為二的方法加于評價，既要看到方法的優(yōu)點，也要重視存在的問題，便于進一步研究加以克服。世界衛(wèi)生組織專家組提出對ELISA的評價認為：“ELISA作為免疫診斷應用是一個好辦法，但要做好它不容易。”因此，還需進一步研究改進，加以完善。從而使之成為對多種疾病診斷較為理想的方法是*可能的。
更新時間：2013-05-27 
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