免疫組化染色實驗步驟

免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC) 現(xiàn)在發(fā)展的已經(jīng)很成熟了，應(yīng)用范圍也比較廣泛，涉及到各個學(xué)科，也是臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)的需要掌握的基礎(chǔ)技術(shù)之一。免疫組化是應(yīng)用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及定量的研究。是臨床病理診斷與科學(xué)研究中的一種方法，其中石蠟組織的免疫組化染色是的技術(shù)。

一、 脫蠟和水化  

Note！脫蠟前將組織芯片放在60℃恒溫箱中烘烤2~3小時

1) 置于二甲苯I中浸泡10分鐘，在二甲苯II中浸泡10分鐘，在二甲苯III中浸泡10分鐘，在二甲苯Ⅳ中浸泡10分鐘；  

2) 無水乙醇I中浸泡5分鐘在無水乙醇II中再浸泡5分鐘；

3) 95%乙醇中浸泡5分鐘；

4) 85%乙醇中浸泡5分鐘；  

5) 70%乙醇中浸泡5分鐘；

6) 蒸餾水中浸泡5分鐘；

抗原熱修復(fù)

A、高溫高壓熱修復(fù) (酸性修復(fù)條件為例)

取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩沖液pH6.0于壓力鍋中大火加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織芯片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋扣上壓力閥繼續(xù)加熱至噴氣，從噴氣開始計時1-2分鐘后壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水洗兩次后，用PBS洗5分鐘。

B、微波熱修復(fù)   (酸性修復(fù)條件為例)

取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩沖液pH6.0于微波盒中微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織芯片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中中，高檔繼續(xù)處理10-15分鐘，取出微波盒冷卻至室溫，取出玻片先用蒸餾水洗兩次，后用PBS洗5分鐘。

酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶，使用前酶預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時間為10-30分鐘

二、免疫組化（IHC）染色

1) 脫蠟水化；

2) PBS洗3次，各6分鐘；

3) 抗原修復(fù)；

4) 用蒸餾水配置新鮮的3%H2O2-甲醇室溫封閉10分鐘；  

5) PBS洗3次，各6分鐘；

6) 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘；

7) 甩去多余液體滴加一抗4℃過夜；

8) 37℃復(fù)溫45分鐘；

9) PBS洗3次，各8分鐘；

10) 滴加二抗，室溫30分鐘；

11) PBS洗3次，各8分鐘；

12) DAB顯色10分鐘在顯微鏡下掌握染色程度；

13) 蒸餾水洗終止染色；

14) 蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化；

15) 脫水透明封片鏡檢；