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Real-time qPCR如何進行數據分析

更新時間:2023-03-21      瀏覽次數:796

Real-time qPCR如何進行數據分析


1. Real-time qPCR常見參數

基線(baseline)

通常是3-15個循環(huán)的熒光信號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

閾值(threshold)

自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍

手動設置:置于指數擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。

Rn(Normalized reporter)是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果(△Rn=Rn-基線)。

2. 影響Ct值的關鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內,使Ct在15-35之間

反應液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應的效率

PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增,與PCR擴增效率高的條件下相比,可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來,反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應的效果

PCR擴增效率:為了正確地評估PCR擴增效率,至少需要做3次平行重復,至少做5個數量級倍數(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。


另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2,它是說明兩個數值之間相關程度的統(tǒng)計學術語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準確預測X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時,兩個數值之間相關的可信度很好。


標準偏差(standard deviation,偏差的平方根)是的精確度計量方法。

如果許多數據點都靠近平均值,那么標準偏差就小;如果許多數據點都遠離平均值,則標準偏差就大。實際上,足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態(tài)分布。這經??赏ㄟ^經典的中心極限理論來證明,獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應效率是 100%,那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度,標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大,分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋,標準偏差必須小于等于 0.250


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