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中性蛋白酶檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

更新時(shí)間:2017-10-10      瀏覽次數(shù):2388

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中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)


測(cè)定意義:
NP 在一定的溫度和中性pH 條件下,催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無(wú)毒、水解能力強(qiáng)、作
用范圍廣等特點(diǎn),中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營(yíng)養(yǎng)保健品生物試劑。
測(cè)定原理:
中性條件下,NP 催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸化合物生
成鎢藍(lán);在680nm 有特征吸收峰。
自備儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、
1.5 mL EP 管和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加4mL 蒸餾水溶解。
試劑三:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加入4mL 試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。
試劑四:粉劑×1 瓶, 4℃保存。臨用前加20mL 蒸餾水溶解。
試劑五:液體4mL×1 瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1 支,0.25μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,4℃保存。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織,
加入1mL 試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。
2. 血清或培養(yǎng)液:直接測(cè)定。
3. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1 的比例(建
議500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3 秒,間隔7
秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到680 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。
3. 對(duì)照管:取0.5 mL EP 管,加入20μL 粗酶液,40μL 試劑二,混勻后置于30℃水浴保溫
10min;加入40μL 試劑三,混勻后8000g,4℃離心10min;取40μL 上清液,加入新的EP
管,再加入200μL 試劑四,40μL 試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL 于微
量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm 測(cè)定光吸收,記為A 對(duì)照管。
4. 測(cè)定管:取0.5 mL EP 管,加入20μL 粗酶液,40μL 試劑三,混勻后置于30℃水浴保溫
10min;加入40μL 試劑二,混勻后8000g, 4℃離心10min;取40μL 上清液,加入新的EP
管,再加入200μL 試劑四,40μL 試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL 于微
量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm 測(cè)定光吸收,記為A 測(cè)定管。(注意與空白管不同,先加
試劑三,后加試劑二)
5. 空白管:取0.5 mL EP 管,加入40μL 蒸餾水,200μL 試劑四,40μL 試劑五,混勻后置于
30℃水浴保溫20min,取200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm 測(cè)定光吸收,記為A
空白管。
6. 標(biāo)準(zhǔn)管:取0.5 mL EP 管,加入40μL 標(biāo)準(zhǔn)品,200μL 試劑四,40μL 試劑五,混勻后置于

30℃水浴保溫20min,取200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm 測(cè)定光吸收,記為A
標(biāo)準(zhǔn)管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。


中性蛋白酶檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)計(jì)算公式:


a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min /mg prot)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V1)÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min /g 鮮重)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
×稀釋倍數(shù)÷(W×V1÷V2)÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
(3)按照液體體積計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min/mL)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×
稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
(4)按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min /104 cell)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
×稀釋倍數(shù)÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2)÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白
管)÷細(xì)胞數(shù)量
C 標(biāo)準(zhǔn)品:0.25 μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液;稀釋倍數(shù):(20+40+40)÷40=2.5;Cpr:粗酶液
蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),注意該粗酶液不能直接用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定,需要另外測(cè)定;建議
稱取同樣質(zhì)量的樣品,加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后,用本公司蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒
測(cè)定;W:樣品質(zhì)量(g);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2 mL;V2:
粗酶液總體積(mL),1mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10min。
b.使用96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min /mg prot)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V1)÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min /g 鮮重)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
×稀釋倍數(shù)÷(W×V1÷V2)÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
(3)按照液體體積計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min/mL)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×
稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
(4)按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
NP 活性單位定義:30℃每104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1 個(gè)酶活單位。
NP 活性(nmol/min /104 cell)=C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)


×稀釋倍數(shù)÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2)÷T= 3125×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白
管)÷細(xì)胞數(shù)量
C 標(biāo)準(zhǔn)品:0.25 μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液;稀釋倍數(shù):(20+40+40)÷40=2.5;Cpr:粗酶液
蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),注意該粗酶液不能直接用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定,需要另外測(cè)定;建議
稱取同樣質(zhì)量的樣品,加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后,用本公司蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒
測(cè)定;W:樣品質(zhì)量(g);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2 mL;V2:
粗酶液總體積(mL),1mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10min。
注意事項(xiàng):
臨用前配制的試劑配制好后4℃保存,并且3 天內(nèi)使用完畢。

中性蛋白酶檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

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