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明膠酶譜法試劑盒使用注意的事項(xiàng)

更新時(shí)間:2017-04-11      瀏覽次數(shù):1623
 明膠酶譜法原理:
 
    酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離,然后在有二價(jià)金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2)和MMP-9恢復(fù)活性,在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠,zui后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色,再脫色,在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶,條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。  
 
復(fù)性原理:在電泳過程中,SDS與樣品中的MMPs結(jié)合(當(dāng)然是可逆性結(jié)合),破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發(fā)揮其分解明膠的作用,而只有當(dāng)將膠置Trition中洗脫(是放在搖床上搖,30min/次,做2次或15min/次,4次。靜置于Trition中是不妥的)時(shí),由于SDS被Trition結(jié)合而去除,從而使MMPs恢復(fù)了活性。
 
明膠酶譜法試劑盒使用時(shí)需要注意的事項(xiàng)如下:
 
1、制備聚丙烯酰胺時(shí)應(yīng)注意排除氣泡。
 
2、明膠酶譜的活性受鈣離子,鋅離子,和PH值等因素的影響,因此緩沖液配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確,盡量用超純水,孵育溫度也掌握好。
 
3、用大梳子。
 
4、孵育液的PH在7.5-7.6,復(fù)性的TRITON時(shí)間長了會(huì)有絮狀物,所以實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配置的。
 
5、孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中,因?yàn)闀?huì)改變孵育液的PH值,在普通孵箱即可。
 
6、明膠要4度保存,配好后1周內(nèi)使用。
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