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信帆生物教你跑出漂亮的大分子western-blot圖

更新時間:2016-12-29      瀏覽次數(shù):3148

選對凝膠很重要

3種zui常見的凝膠包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝膠的PH為8.6,且保質(zhì)期很短。在跑膠的過程中,PH還有上升的趨勢,可達(dá)到9.5。這會導(dǎo)致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝膠的PH為6.4,相對Tris-Glycine凝膠,穩(wěn)定性和保質(zhì)期都有所增加。但這種凝膠需要在溶液中增加抗氧化劑,比如DTT,以維持蛋白的還原性。

Tris-Acetate 凝膠的PH為7,跑大分子蛋白會呈現(xiàn)很高的分辨率。 跑大分子蛋白時,我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠。

凝膠濃度很重要

既然選擇了Tris-Acetate 凝膠,還有幾個要考慮的問題。凝膠濃度與孔徑成反比:濃度越小,孔越大。較大的蛋白質(zhì)更容易通過較大的孔,所以我建議使用低百分比的凝膠,如7%??梢允褂锰荻饶z或非梯度凝膠,梯度凝膠非常適合新樣本。

提高轉(zhuǎn)移buffer中的SDS,減少甲醇

轉(zhuǎn)移buffer的組成至關(guān)重要。如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。通過減少轉(zhuǎn)移buffer中的甲醇百分比(10%或更低)來避免這種情況發(fā)生。 為了進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)不會沉淀,考慮添加SDS至終濃度為0.1%。SDS向蛋白添加均勻的負(fù)電荷,使得它們更容易從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。

選擇合適的膜

膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白選擇PVDF膜。如前面所說,如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在轉(zhuǎn)移buffer中添加甲醇,目的蛋白轉(zhuǎn)印的機(jī)會更高。兩種類型的膜都有各種孔徑尺寸,zui常見的是0.2um和0.45um。與凝膠一樣,較大的蛋白比較小的更容易穿過大孔隙。大多數(shù)蛋白質(zhì)(> 20kDa)可以用0.45um膜轉(zhuǎn)移,避免使用0.2um孔徑。

增加轉(zhuǎn)印時間

在正確的選擇完凝膠、轉(zhuǎn)印膜及轉(zhuǎn)移buffer后,轉(zhuǎn)印正式開始。半干轉(zhuǎn)快且方便,但不適用于大分子蛋白。我建議濕轉(zhuǎn),因為大分子蛋白轉(zhuǎn)移時間很慢,推薦350-400 mA轉(zhuǎn)移90min或 4°C,40 mA,轉(zhuǎn)印留夜。

 

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ELISA試劑盒:進(jìn)口ELISA試劑盒,國產(chǎn)ELISA試劑盒,人elisa試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒等。
培養(yǎng)基:微生物培養(yǎng)基,顯色培養(yǎng)基,BD培養(yǎng)基,gibco培養(yǎng)基等。
血清:胎牛血清,科研血清,動物血清,NQBB,Hyclone,Gbico原裝血清 。
生物試劑:Amresco,Sigma,ABM,BIO-RAD,BD,ABCAM等進(jìn)口試劑。
標(biāo)準(zhǔn)品對照品:進(jìn)口對照品,進(jìn)口對照藥材,進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品.
抗體:一抗,二抗,流式抗體等。
放免試劑盒:進(jìn)口放免試劑盒,國產(chǎn)放免試劑盒,進(jìn)口美國鳳凰等放免試劑盒。
實驗室代測服務(wù):放免代測,WB實驗,免疫組化代測,熒光定量PCR代測,病理細(xì)胞染色代測,生化實驗代測等。

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